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非洲豬瘟病毒檢測整體解決方案
更新時間:2019-02-28   點擊次數(shù):3676次

非洲豬瘟病毒DNA檢測方案

 

 

1.常見樣本類型:

分泌物、血液、脾臟、扁桃體、腎臟和淋巴結(jié)等樣本中的非洲豬瘟。

2.. 樣品預(yù)處理方式(樣本處理區(qū))

2.1 樣本前處理

2.1.1組織樣品:每份組織分別從 3 個不同的位置稱取樣品約 1g,手術(shù)剪剪碎混勻后取

0.5g 于研磨器中研磨,加入 1.5mL 生理鹽水后繼續(xù)研磨,待勻漿后轉(zhuǎn)至 1.5mL 滅菌離心管中,8000rpm 離心2min,取上清液 200μL  1.5mL 滅菌離心管中;病樣組織直接上機(jī)提取也有實驗室在用(江蘇泰州農(nóng)委)

2.1.2全血樣本:取全血離心后的上清(血清) 200μL  1.5mL 滅菌離心管中。

相關(guān)實驗設(shè)備:動物組織研磨儀、手持式電動組織研磨儀

 

 

根據(jù)樣本數(shù)量多少可用高通量組織破碎儀或者手持式組織研磨儀破碎組織樣本,之后用離心機(jī)將樣本離心分層,取上清液。

2.2樣本保存和運輸

上述標(biāo)本短期內(nèi)可保存于-20℃,長期保存可置-70℃,但不能超過 6 個月,標(biāo)本運送應(yīng)采用 藍(lán)和干冰運輸,嚴(yán)禁反復(fù)凍融。

 

2.3 DNA 提取

對上述處理好的標(biāo)本加入到預(yù)裝好提取試劑的96深孔板中,將加好樣本的耗材放置到96全自動核酸提取儀中提取核酸。

 

96全自動核酸提取儀用于病毒核酸的提取,配套提取試劑可以以散裝形式提供,也可以以預(yù)裝的形式提供,96高通量移液工作站可以用于散裝試劑的分裝。

 

3. 試劑配制(試劑準(zhǔn)備區(qū))

根據(jù)待檢測樣本總數(shù),設(shè)所需要的 PCR 反應(yīng)管管數(shù)為 N(N=樣本數(shù)+1 管陰性對照+1 管陽性對照;樣品每滿 7 份,多配制 1 ),將上游引物、下游引物、熒光定量探針、酶液預(yù)混好,將混合好反應(yīng)液分裝到 PCR 反應(yīng)管中。舉例如下:

 

4. 加樣(樣本處理區(qū))

將提取的 DNA、陽性質(zhì)控品、陰性質(zhì)控品各取一定量,分別加入相應(yīng)的反應(yīng)管中,蓋好管蓋,混勻,短暫離心。

                                                              

 

5. PCR 擴(kuò)增(核酸擴(kuò)增區(qū))

5.1 將待檢測反應(yīng)管置于熒光定量 PCR 儀反應(yīng)槽內(nèi);

5.2 設(shè)置好通道、樣品信息,反應(yīng)體系設(shè)置為 20μL

熒光通道選擇: 檢測通道(Reporter DyeFAM, 淬滅通道(Quencher DyeNONEABI 系列儀器請勿選擇 ROX 參比熒光,選擇 None 即可。

5.3 相關(guān)設(shè)備:

BTK-6 熒光PCR儀、BTK-10 超快速熒光PCR儀、ABI7500、LightCycler、Bio-Rad、eppendorf 等系列熒光定量 PCR 檢測儀。

6. 結(jié)果分析判定

按照非洲豬瘟核酸檢測試劑盒指導(dǎo)進(jìn)行判讀。

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相關(guān)設(shè)備及試劑

產(chǎn)品編號

產(chǎn)品名稱

備注

AU1001-96

96全自動核酸提取儀

 

AU1001

32全自動核酸提取儀

 

AU1096A

96高通量移液工作站

 

AU52011-96

磁珠法病毒DNA/RNA提取試劑盒(預(yù)裝)

96次

CK2160

臺式高速離心機(jī)

配3號角轉(zhuǎn)子:  24×1.5/2.2ml

PR7901

DNA病毒熒光PCR反應(yīng)液

50次

PR7911

非洲豬瘟病毒熒光PCR檢測試劑盒

48次

BTK-6

熒光定量PCR儀

 

 

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